Электрофорез и хроматография — Методы исследования в клинической биохимии

Электрофорез.

Электрофорез (от электро… и греческого рhoresis – перенесение) – направленное перемещение заряженных частиц в дисперсионной среде под действием внешнего постоянного электрического поля к противоположно заряженному электроду.

Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как

размеры (или молярная масса),

причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности.

Физический принцип метода заключается в следующем. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор пропускать электрический ток, то под действием электрического поля макромолекулы в соответствии со своим зарядом мигрируют в направлении катода или анода. В зависимости от величины заряда и размеров молекулы приобретают разные скорости, и в этом — сущность процесса разделения смеси белков методом электрофореза. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны или фракции, содержащие одинаковые молекулы.

Факторы, влияющие на электрофоретическую подвижность

Молекула белка в растворе при любом значении рН, отличающемся от изоэлектрической точки, имеет определенный заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле (макрокатион к катоду, макроанион к аноду). На электрофоретическую подвижность белковых молекул влияют следующие факторы:

Размер и форма макромолекулы.

Чем больше величина заряда белковой молекулы, тем выше ее электрофоретическая подвижность из-за увеличения силы электростатического притяжения с противоположно заряженным электродом.

Напряженность электрического поля (Н, В/м)

Характер буферного раствора

Электрофорез сыворотки крови обычно проводят при нейтральных или слабощелочных рН = 8,6, когда большинство белков мигрирует к аноду.

Чаще всего в качестве носителей используют относительно инертные вещества, но их состав все же оказывает влияние на подвижность разделяемых веществ, и, выбор носителя зависит от природы образца.

Методы электрофореза

Существует множество разновидностей и модификаций метода электрофореза, которые используются в различных областях.

Выделяют три основных типа электрофоретических систем: электрофорез с подвижной границей, зональный электрофорез и стационарный (вытесняющий) электрофорез.

Электрофорез белков подразделяется также на одномерный и двумерный, препаративный и аналитический, а также электрофорез нативных белков. В случае использования иммунологических методов для выявления разделенных белков используется иммуноэлектрофорез.

Зональный электрофорез

В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. При этом методе разделение производят в закрепленной среде. Наиболее распространены методы разделения на пористых носителях.

Электрофорез на бумаге. Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. Носителем служит специальная хроматографическая бумага, которую разрезают на полоски требуемого размера. Наносят сыворотку крови на катодный конец смоченной буферным раствором полоски. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. Скорость движения белков пропорциональна величине их электрического заряда. За определенное время белковые фракции пройдут различный путь и разделятся.

Схема прибора для электрофореза на бумаге.

Затем белки фиксируют высушиванием и красят красителями. Окрашенные зоны белковых фракций вырезают и элюируют специальным растворителем (растворNaOH) для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови получается до 5 фракций: альбумины, 1-, 2-, -, -глобулины.

Электрофореграмма сыворотки крови на хроматографической бумаге:

1 – альбумин, 2 – 1-глобулин, 3 – 2-глобулин, 4 – -глобулин, 5 – -глобулин.

Электрофорез на ацетатцеллюлозной мембране. Мембрана ацетатцеллюлозы как носитель для электрофореза имеет ряд преимуществ по сравнению с бумагой: однородность, строго определен­ный размер пор, пониженная адсорбционная способность, что исключает образование размытых полос позади зон. Для окрашивания зон применяют методы аналогичные методам окрашивания зон на бумаге.

Электрофорез в гелях. В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый, полиакриламидный гели. Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле. Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выявляется до 7-8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле – до 20 фракций. Агаровый гель ввиду большого количества воды в нем и вследствие этого большой скорости движения ионов используется в иммуноэлектрофорезе для обнаружения антигенов. Самым перспективным является полиакриламидный гель, так как он прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен, размер пор у этого геля можно варьировать в широких пределах и его можно использовать с самыми различными буферными растворами. Скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе.

Читайте также:  Дарсонваль для лица, для волос

Фотография электрофореграмм смеси белков, разделенных в полиакриламидном геле, иллюстрирующая разделение белков по заряду и молекулярной массе.

Вариантов проведения электрофореза в полиакриламидном геле много (вертикальный в трубках и горизонтальный на пластинах).

Схема простейшего прибора для электрофореза в геле

а — до фракционирования,

б — после его окончания

Схема прибора для электрофореза в горизонтальных пластинах

1-антиконденсационная крышка;

2 – электродный резервуар;

3 — колодец для внесения препарата; 4 гель; 5 — фитиль;

6-охлаждающий столик

Вытеснительный электрофорез.

Этот метод характеризуется тем, что через некоторое время после разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся изоэлектрическое фокусирование.

Изоэлектрическое фокусирование. Это метод разделения белков, основанный на перемещении их молекул под действием постоянного электрического тока в область с величиной рН, соответствующей изоэлектрической точке данного белка. Между анодом и катодом создается градиент рН с помощью амфолитов. Каждый белок мигрирует к соответствующему электроду и прекращает движение, попадая в зону с pH = pJ (фокусируется). Таким образом, молекулы, имеющие одинаковую изоэлектриче­скую точку, сконцентрируются в узкой зоне.

Двумерный электрофорез

  • Электрофорез двумерный — способ разделения сложных смесей белков, в котором сочетаются электрофорез белков в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и изоэлектрическое фокусирование. Этот метод увеличивает разрешение одномерного гель-электрофореза, а также позволяет исследовать неканонические структуры, возникающие в сверхспирализованной молекуле кольцевой ДНК. Оценить размер молекул помогут маркеры молекулярных масс. Последующая детекция на гельдокументирующих системах позволит визуализировать результат.

Реактивы для горизонтального электрофореза: агарозы, маркеры длин фрагментов ДНК, красители интеркалирующие для визуализации НК, красители для нанесения образцов на гель, буферы для электрофореза нуклеиновых кислот.

Готовые полиакриламидные гели удобны в применении, разработаны под различное количество образцов (от 1 до 26 лунок) и адаптированы к различным по размеру электрофорезным камерам. Готовые стрипы для двумерного электрофореза доступны в широком спектре диапазонов pH, длиной от 7 до 24 см.

Для автоматического препаративного электрофореза — при отделении необходимого фрагмента автоматически — используются системы препаративного электрофореза для разделения и выделения ДНК/РНК/белков серии Pippin, производства Sage Science.

Другие типы электрофореза: вертикальный, горизонтальный, капиллярный, капиллярный на чипе.

Связанные понятия

Дот-блот — техника, используемая в молекулярной биологии для детекции различных макромолекул, таких как нуклеиновые кислоты или белки. Данная техника является некоторым упрощением вестерн-блота: образцы, содержащие исследуемые макромолекулы наносятся сразу на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, минуя стадию предварительного электрофореза в ПААГ (в частности при работе с белками).

Тканевая матрица (ТМА, tissue microarray, тканевой мастер-блок, множественно-тканный парафиновый блок ) — в медицине, парафиновый блок-реципиент в который встроены множественные тканевые цилиндры, извлеченные из стандартных парафиновых блоков-доноров и организованные в виде упорядоченной последовательности (матрицы). ТМА позволяют сохранять и использовать ценные тканевые ресурсы более эффективно и экономично для гистохимического, иммуногистохимического (ИГХ) и молекулярного исследований.

Читайте также:  Цинковая мазь при ветрянке у детей и взрослых

MTT-тест — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. НАДФ-H-зависимые клеточные оксидоредуктазные ферменты могут, при определенных условиях, отражать количество жизнеспособных клеток. Эти ферменты способны восстанавливать тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид в нерастворимый формазан, который имеет пурпурное окрашивание. Другие близкородственные тетразолиевые красители: XTT, MTS и WST, которые используются в связи с промежуточным.

Протеомика

Нашей лабораторией ведется исследование белков клеточных стенок растительных клеток методами протеомики. Особое внимание в наших исследованиях уделено вторичной клеточной стенке желатинозного типа, которую формируют исключительно растительные волокна, и сравнительному анализу протеома вторичной клеточной стенки ксиланового и желатинозного типа. В качестве модельных систем нами выбраны растения, ткани которых формируют клеточные стенки и ксиланового типа и желатинозного. Такими модельными системами служат растения льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) и конопли (Cannabis sativa L.), в которых клетки ксилемы формируют вторичную клеточную стенку ксиланового типа, а флоэмные волокна – вторичную клеточную стенку желатинозного типа. Это позволяет сравнивать белки, характерные для того или иного типа клеточных стенок, сформированных в одних и тех же условиях окружающей среды, на одной стадии развития растения.

Протеомика клеточных стенок столкнулась с рядом трудностей, связанных как с самой структурой клеточных стенок, так и с природой клеточно-стеночных белков, что усложнило процедуру их экстракции, разделения и дальнейшей идентификации. Клеточная стенки не окружена мембраной, как большинство других субклеточных компартментов, что делает особенно вероятными и потери белков, и попадание во фракцию чужеродных полипептидов. Особенно это касается щелочных белков, которые могут ионно взаимодействовать с уроновыми кислотами пектиновых веществ. Именно такое взаимодействие характерно для многих канонических белков клеточной стенки: из них более 60% имеют pI в диапазоне от 8.0 до 12.9 (Jamet et al., 2006). Таким образом, необходимо тщательно отрабатывать методы выделения клеточной стенки, использовать адекватные контроли и альтернативные подходы для локализации белка. Тем не менее, несмотря на трудности, протеомика клеточных стенок стала активно развивающимся направлением в современной клеточной биологии (Boudart et al., 2007).

  1. экстракция белков клеточной стенки;
  2. разделение клеточно-стеночных белков с помощью одномерного / двумерного электрофореза или жидкостной хроматографии;
  3. идентификация индивидуальных белков путем анализа масс-спектров фрагментов, полученных в результате частичного гидролиза.

1. Экстракция белков клеточной стенки.

Наиболее оригинальная часть связана с разработкой метода выделения изолированных флоэмных волокон льна и последующей экстракцией из них белков клеточной стенки. Флоэмные волокна льна (Linum usitatissimum L.) являются уникальной моделью для установления общих закономерностей биогенеза растительной клетки с использованием разноплановых подходов, в том числе функциональной геномики и протеомики. Волокно как модельная система позволяет избежать ряд трудностей, связанных с гетерогенностью растительного образца. Так, на стадии формирования вторичной клеточной стенки волокна можно отделить от окружающих тканей с помощью отмывки в этаноле после лиофилизации (рис. 1). Это дает возможность изучения протеома определенного типа клеток на определенной стадии их развития, а также и отдельных субклеточных структур. Расположенные вдоль всего стебля волокна собраны в пучки, что облегчает их обнаружение и выделение, делая возможным проведение исследований на уровне однотипных клеток.

Рис. 1. Получение изолированного волокна.

Обособленность отдельных стадий биогенеза волокна, а также наличие так называемой «точки слома» – морфологического индикатора перехода волокон от удлинения клетки к утолщению стенки, позволяют изучать специфичные для стадий процессы. Уникальность флоэмного волокна льна проявляется также в слабой лигнификации вторичной клеточной стенки, что облегчает экстракцию составляющих ее полимеров. Чтобы получить волокна, активно формирующие вторичную клеточную стенку, участки стебля ниже «точки слома» разделяли на флоэмную и ксилемную части. На этом участке стебля волокна имеют толстую вторичную клеточную стенку, пучки волокон легко отделяются со слоем коровой паренхимы и эпидермисом, причем разделение происходит по внутренней стороне пучка. Эпидермис и большая часть паренхимных клеток удаляется при тщательном отмывании ткани.

Читайте также:  Мерзнут ноги даже в тепле причины, что делать

В нашей работе исследовались экстрагируемые солями белки, которые относятся к слабо связанным белкам клеточной стенки. Выделение клеточной стенки и экстракцию белков проводили согласно протоколу, разработанному Л. Фейз с соавторами (Feiz et al., 2006), с некоторыми модификациями. Схема эксперимента: изолированные волокна тщательно размельчали в жидком азоте. Далее проводили:

  1. гомогенизацию и последовательное центрифугирование в растворах с высокой плотностью сахарозы (0.4 М, 0.6 М и 1.0 М) в 5 мМ ацетатном буфере, рН 4.6;
  2. интенсивную отмывку осадка 5 мМ ацетатном буфером, рН 4.6 (не менее 2 л на 8 г сырой ткани);
  3. Белки экстрагировали последовательно 0.2 М CaCl2 и 2.0 М LiCl (в 5 мМ ацетатном буфере, рН 4.6 с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ (Sigma, США));
  4. Полученный супернатант обессоливали на G-25 (15 х 50 мм, GE Health Care, Sweden, Supelco, USA);
  5. Белки осаждали 80% ацетоном в течение ночи при -20ºC.

2. Разделение клеточно-стеночных белков. Для разделения белков использовали одномерный электрофорез (1D-электрофорез), т.к., согласно данным литературы, технология двумерного электрофореза менее эффективна для разделения белков клеточной стенки. Причем более обогащена белками фракция, экстрагируемая 0.2 М CaCl2, именно эта соль считается самой эффективной для извлечения клеточно-стеночных белков из высших растений (рис. 2).

Рис. 2. Электрофореграмма клеточно-стеночных белков ксилемной части стебля льна и флоэмных волокон, экстрагируемые солями.

3. Идентификация индивидуальных белков путем анализа масс-спектров фрагментов, полученных в результате частичного гидролиза Для трипсинолиза с последующим получением масс-спектров (на базе Центра Коллективного Пользования ИБМХ) вырезали из геля белковые полосы. В каждом образце присутствовали пептиды нескольких белков, что делало получаемый спектр более сложным и, вероятно, отразилось на эффективности идентификации. Полученные для всех образцов пептидные спектры помещали в поисковую программу Mascot. Для идентификации белков по поиску гомологичных пептидных масс (Peptide Mass FingerPrint) отбирали только качественные спектры: учитывали наличие трипсиновых фрагментов, количество пептидов и интенсивность сигналов. Для идентификации белков использовали базу данных NCBInr и SwissProt. Для установления принадлежности обнаруженного белка к клеточной стенке аминокислотную последовательность (из базы данных NCBInr и Swissprot), проверяли на наличие сигнального пептида, ответственного за экстраклеточный транспорт, с помощью программ TargetP и SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/TargetP, www.cbs.dtu.dk/services/SignalP), а также Phobius (http://phobius.sbc.su.se/), PS-Scan (http://expasy.org/prosite). Для установления субклеточной локализации белка помимо TargetP использовали также программы Psort (http://wolfpsort.org/), Predotar (http://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html). Те белки, которые согласно этим программам были идентифицированы как экстраклеточные, дополнительно проверяли на наличие трансмемебранного домена с помощью программы TMHMM (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) , а также концевых последовательностей аминокислот KDEL и HDEL, ответственных за удержание белка в эндомембранной системе. Принадлежность к неклассическим белкам внеклеточного матрикса устанавливали при помощи программы SecretomeP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP-1.0).

С помощью целого комплекса подходов, включая методы протеомики, нами был охарактеризован индивидуальный белок клеточной стенки – бета-галактозидаза; для характеристики использовали методы хроматографии, электрофорез, электроэлюцию, иммуноферментный анализ, иммуноцитохимию, ПЦР в реальном времени, масс-спектрометрию. Это позволило в полной мере охарактеризовать белок, выявить его активность, выявить и оценить экспрессию гена данного белка, обнаружить продукты реакции исследуемого фермента:

Roach M.J., Mokshina N.Y., Snegireva A.V., Hobson N., Deyholos M.K., Gorshkova T.A. Development of Cellulosic Secondary Walls in Flax Fibers Requires beta-Galactosidase // Plant Physiology. 2011. V.156. P. 1351-1363.

Мокшина Н.Е., Ибрагимова Н.Н., Сальников В.В., Аменицкий С.И., Горшкова Т.А. Галактозидаза растительных волокон с клеточной стенкой желатинозного типа: идентификация и локализация // Физиология растений. 2012. Т.59. №2 (в печати).

Ссылка на основную публикацию
Электрокоагуляция доброкачественных новообразований кожи
Электрокоагуляция папиллом Электрокоагуляция папиллом – широко применяемый на протяжении нескольких десятилетий метод удаления новообразований кожи при помощи электрического тока. Услуга...
Шрифт Meta Pro-Bold Скачать
FF Meta Pro Bold шрифт Просмотр шрифта Символы шрифта Форматы шрифта Доступные форматы Файл шрифтаФормат шрифтаВерсияСимволовРазмерff-meta-pro-521.otfOTF - OpenType—691379 Kb FF...
Штаргардта болезнь, причины болезни, симптомы и методы лечения
Штаргардта болезнь OMIM 248200 Наша команда профессионалов ответит на ваши вопросы Болезнь Штаргардта 1 типа (Stargardt disease, STGD) и абиотрофия...
Электролитный дисбаланс симптомы и лечение — Medical Insider
Нарушения калий-магниевого гомеостаза в клинической практике: коррекция сбалансированным раствором калия и магния аспарагината Представлены факторы риска, клинические проявления и диагностика...
Adblock detector